ͥ婶鮱롿 ޫ櫲񯮭ὠ¨⬨ﳥ랠rosmedic.ru
Фотометрические методы измерения свойств биологических объектов

Фотометрией называют раздел физической оптики, в котором рассматриваются энергетические характеристики оптического излучения в процессах его испускания, распространения и взаимодействия с веществом.

Взаимодействие лучистой энергии с анализируемым веществом оценивается с помощью:

  • абсорбционного анализа, анализа по поглощению света веществом, свойства которого определяются (спектрофотомерия, фотоколориметрия);
  • анализа по поглощению и рассеянию лучистой энергии взвешенными частицами определяемого вещества (турбидиметрия, нефелометрия);
  • флоурометрического (люминесцентного) анализа, основанного на измерении вторичного излучения, возникающего в результате взаимодействия лучистой энергии с веществом.

При фотоколометрических и спектрофотометрических измерениях оценивается поглощение света в определяемом веществе. При прохождении света через вещество часть его отражается, часть поглощается, часть рассеивается, а часть проходит через слой этого вещества. Интенсивность светового потока I0, падающего на слой вещества, можно условно разложить на четыре составляющие: I0=I+ Iп+ Iот+ Iр,

где I - интенсивность светового потока, прошедшего через слой вещества; Iп - интенсивность светового потока, поглощенного веществом; Iот - интенсивность светового потока, отраженного веществом; Iр - интенсивность светового потока, рассеянного средой.

Под интенсивностью света понимается мощность (энергия) светового потока, испускаемого источником света в 1 с внутри телесного угла, равного единице

При прохождении монохроматического светового потока через слой вещества, светопоглощение в нем характеризуется законом Бугера-Ламберта-Бера (закон колориметрии).

Image

где I, I0- интенсивности светового потока, падающего на вещество и прошедшего через него;

а - коэффициент светопоглощения;

с - концентрация растворенного вещества;

l - толщина поглощающего слоя.

Если концентрация с выражена в молях на литр, l - в сантиметрах, то а - становится молярным коэффициентом светопоглощения ελ

Уравнение колориметрии принимает вид: Image

Моль (М) единица количества вещества. В 1М содержится столько молекул, сколько содержится в 0,012 кг 12С (нуклида углерода с атомной массой 12). В 1 М хлорида натрия имеется 58,454 г NaCl в 1 литре раствора.

Если закон светопоглощения соблюдается, то оптическая плотность раствора D прямо пропорциональна молярному коэффициенту светопоглощения ελ, концентрации вещества с и толщине раствора l Image

Молярный коэффициент светопоглощения зависит от длины волны проходящего света, температуры вещества и его природы, и не зависит от концентрации растворенного вещества и толщины поглощающего слоя.

Для слабоокрашенных веществ ελ≈ 400÷500; у наиболее интенсивно окрашенных ελ≈ 100000.

Закон Бугера-Ламберта-Бера получен с использованием закона Бугера-Ламберта, в соответствии с которым однородные слои одного и того же вещества одинаковой толщины поглощают одну и ту же долю падающей на них световой энергии

Image

а также закона Бера

Image

где K 1- коэффициент пропорциональности.

Закон Бера утверждает, что оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества при постоянной толщине поглощающего свет слоя. Интенсивность светопропускания в зависимости от толщины слоя вещества и зависимость оптической плотности от концентрации вещества в растворе иллюстрируются рис. 1

Image
Рис. 1 Кривая интенсивности светового потока в зависимости от толщины слоя вещества (а); зависимость оптической плотности от концентрации раствора (б)


Оптическая плотность D и светопропускание связаны между собой зависимостью D= lgT,

где Т- светопропускание Image

Оптическая плотность D измеряется в Беллах [Б]. Значение ее обычно находится в пределах 0÷2 Б, иногда до 3 Б и более. Светопропускание обычно оценивается в процентах. Оптическая плотность 0 Б соответствует 100% светопропускания, 2 Б- светопропусканию в 1% .

Если используется не монохроматический, а полихроматический источник света, то вместо молярного коэффициента ελ в уравнения подставляется средний молярный коэффициент светопоглощения ε, зависящий от спектрального состава источника излучения.

На практике наблюдаются отклонения от закона Бера, вследствие действия ряда химических факторов. Это обстоятельство приходится учитывать при проведении измерений.

Молярный коэффициент светопоглощения и оптическая плотность раствора различны для разных длин волн света. Поэтому для полной характеристики растворов различных соединений используются спектры поглощения. Для этого проводят измерения оптической плотности раствора или молярного коэффициента светопоглощения при различных длинах волн D=f(λ); ελ= f (λ ) и строят кривые, характеризующие светопропускание. Для получения большей надежности результатов при фотометрировании стремятся использовать тот участок спектра излучения, на котором наблюдается максимальное светопоглощение данным веществом.

При спектрофотометрии оценивается светопропускание лучистого излучения веществом или веществами в зависимости от длины его волны. От фотоколоритмии она отличается только тем, что в соответствующих приборах используются источники монохроматического света, интервал длин волн которых порядка (1÷2 нм). Для этого широко используются специальные светофильтры, устанавливаемые на пути прохождения световых потоков перед поглощающим свет веществом.

Светофильтры пропускают лучи лишь в определенном интервале длин волн, с полушириной пропускания Image (рис. 2). У хороших светофильтров размытость максимума пропускания превышает 20÷30 нм.

Image
Рис. 2 Спектральная кривая светопропускания светофильтра


По сравнению с фотоколориметрическими методами у спектрофотометрических следующие преимущества:

  • повышенная чувствительность и точность количественного определения концентрации веществ;
  • возможность анализа систем, содержащих несколько компонентов, не взаимодействующих друг с другом и имеющих различные спектральные коэффициенты поглощения;
  • возможность анализа растворов, которые бесцветны для глаза (при их исследовании в ультрафиолетовой 200÷400 нм или ближней инфракрасной 760÷1100 нм областях спектра).

Фотометрические и спектрофотометрические методы широко используются в медицине и биологии при получении информации о концентрациях веществ, находящихся в жидкостях проб, а также при определении параметров, характерных для определенного объекта. При этом, в ряде случаев, определяемые вещества окрашиваются с помощью тех или иных красителей, как это, например, имеет место при электрофоретическом фракционном анализе белков сыворотки крови



Битва за Ленинград занимает особое место в Великой Отечественной Войне по своей продолжительности, упорству, невиданной стойкости и трагедии, пережитой защитниками блокированного города. ленинградская битва Подробно узнать историю ленинградской битвы в последовательной хронологии Вы сможете, посетив наш сайт.


 
След. »
 
 
Rambler's Top100